Protocol：凝胶阻滞迁移率检测（EMSA）实验方法_实验干货_实用技巧

实验简介

凝胶阻滞迁移率检测（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）是一种研究转录因子与DNA结合的技术，可用于定性和定量分析。基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，在非变性聚丙烯凝胶上电泳时，探针与蛋白质结合后分子量变大，比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后，同时自由探针含量也减少。EMSA可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白, 并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，结合蛋白双向电泳及质谱技术进行未知蛋白的鉴定分析[1]。

EMSA的优点是简单迅速且灵敏度高；缺点是很难鉴定低亲和力的结合元件，无法鉴定蛋白复合体与DNA之间的结合，也不能反映体内蛋白与DNA的结合。

实验材料

表达载体 pET-28a (Novagen)、大肠杆菌BL21菌株。

图1 表达载体 pET-28a

（引自杨立文等，植物学报2020）

试剂

DNA探针序列
5× TBE(1L)：54 g Tris、27.5 g硼酸和20 mL 0.5 M EDTA(pH8.0)。
6% TBE凝胶(25mL)：2.5 mL 5× TBE、5 mL 30%丙烯酰胺(Cat No.A3291), 17.325 mL ddH2O, 150 μL 10% APS(Cat No.MKCg5404)和25 μL TEMED(Cat No.T22500)。
结合缓冲液：2 μL 10×结合缓冲液(EMSA试剂盒)，1 μL 50%甘油，1 μL 100 mM MgCl2，1μL 1μg/μL–1PolydI:dC，1μL 1%NP-40。
生物素标记试剂盒（Thermo Scientific，Cat No.89818）。
EMSA试剂盒（LightShift，Cat No.20148）。
化学发光核酸检测试剂盒（Thermo Scientific，Cat No.89880）。

仪器

PCR仪，电泳仪，转膜仪，紫外切胶仪和化学发光检测仪。

实验设计要求

1. 选取转录因子可能结合的顺式作用元件以及前后各5 bp的侧翼序列，按照同一方向串联3次，组成探针。

2. 为确定转录因子与特定顺式作用元件结合的特异性，需添加竞争组作为对照实验。即利用未标记的野生型探针和未标记的突变型探针进行EMSA分析。

实验流程

实验前请详细阅读试剂盒说明书。

1. 合成DNA探针，包括野生型探针和突变型探针。

2. 标记探针。通常使用生物素标记，与32P相比不具有放射性，且便于操作。为确定转录因子与特定顺式作用元件结合的特异性，需按照以下顺序配制标记组和竞争组的反应体系。

标记组：12.5 μL超纯水，5 μL 5× TdT缓冲液，2.5 μL 1 μM未标记的Oligo，2.5 μL 5 μM Biotin-11-UTP，2.5 μL 2 U/μL DilutedTdT。
竞争组：20 μL超纯水，2.5 μL 10× 结合缓冲液(含Mg2+)，2.5 μL 50 μM未标记的Oligo。

37°C避光孵育30分钟。
加入1.25 μL 0.2 M EDTA终止反应，然后加入25 μL氯仿：异戊醇(1:1)，旋涡振荡混匀，16000 ×g离心1–2分钟，取上清。
随后转移至90°C孵育2分钟，缓慢降温至60°C，最后于60°C孵育30分钟。

3. 6% TBE凝胶制备及预电泳。按照配方依次加入各成分并充分混匀，注意在灌胶过程中要防止气泡的产生。待TBE凝胶完全凝固后开始预电泳，90V电泳1–2小时，电泳缓冲液为0.5× TBE缓冲液。

4. 蛋白与探针结合反应。按照以下配方配制结合反应体系。

实验组：50ng融合蛋白，0.5–2μL标记探针，6μL结合反应缓冲液，用超纯水定容至20 μL。
竞争组：50 ng融合蛋白，0.5–2 μL标记探针，过量的野生型未标记探针或突变型未标记探针，6 μL结合反应缓冲液，用超纯水定容至20 μL。

注意：通常未标记野生型或突变型探针的用量为标记探针的10倍、50倍和100倍。PolydI:dC可抑制蛋白与DNA的非特异性结合，避免形成假复合物。

5. 电泳。结合反应完毕后加入5 μL上样缓冲液，充分混匀再进行上样。电压90V，待指示剂到达胶的3/4处时即可停止电泳。

6. 转膜。将尼龙膜小心取出，放入0.5× TBE转膜缓冲液中，依次按照黑面-纤维垫-2层滤纸-胶-尼龙膜-2层滤纸-纤维垫-白面的顺序放置，注意不要有气泡产生。380 mA工作60分钟。

7. 紫外交联。取出尼龙膜用吸水纸吸干水，蛋白面朝下放入紫外交联仪中，紫外交联15分钟。

8. 封闭。将紫外交联后的尼龙膜置于干净的平皿中，加入10 mL封闭缓冲液（EMSA试剂盒），轻柔摇动15分钟。

9. 杂交。轻轻倒掉封闭缓冲液，加入8 mL结合/封闭缓冲液（EMSA试剂盒），轻柔摇动15分钟。

10. 漂洗。将尼龙膜转移至新的平皿中，加入10 mL 1× 漂洗液，轻柔漂洗5分钟，重复漂洗3次。

11. 平衡。将尼龙膜转移至新的平皿中，加入15 mL底物平衡缓冲液，轻柔摇动15分钟。取出尼龙膜，吸干多余的底物平衡缓冲液，

12. 发光检测。置于新的平皿中。加入6 mL化学发光底物至完全覆盖尼龙膜，静置孵育5分钟。最后，取出尼龙膜，从侧面吸干多余的化学发光底物，用保鲜膜包被，在化学发光成像系统（Bio-step）中曝光5分钟进行显影。

9. 数据分析。通常情况下，可以从两方面分析EMSA数据，即底部的自由探针和位于上方的迁移条带（蛋白-DNA复合物）。在加入等量标记探针的前提下，当蛋白与DNA产生互作时，底部的自由探针减少，迁移条带亮度增强。在此基础上增加未标记野生型探针会与标记探针竞争蛋白，此时自由探针条带强度基本不变，迁移条带亮度减弱；而当增加未标记的突变探针时，由于蛋白不结合该序列，突变探针不与标记探针竞争，此时自由探针减少，迁移条带亮度增强。

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