科研星球

质粒相关知识点常见问题汇总

  小白是一个实验新手,实验室其他人员大提质粒都能提到mg级别,小白提的质粒却一直只能得到一百多微克,这是为什么呢?

    今天我们不解决小白问题的,而说说知识点。要解决小白问题,我们得先来了解下质粒。



高拷贝数/低拷贝数


我们常常会听到“拷贝数”,拷贝数就是每个细菌/细胞内质粒的个数,自然是决定了最终所能获得质粒的量。

那么谁控制着质粒的拷贝数呢?

质粒的复制子决定了质粒的拷贝数,目前大部分的质粒的复制子都是来自同一个祖先pMB1, 该复制子能达到的拷贝数为15-20。经过漫长的改造,pMB1改造而得到的pUC质粒拷贝数能够达到惊人的500-700。

你想想,用pUC载体大提质粒的时候得到的量是不是多很多?

那么到这里你可能会问,低拷贝数的质粒有毛用?

确实,低拷贝数的质粒用途不是十分广阔,主要用于以下两点:

1.    不稳定的DNA序列克隆或者在高拷贝数质粒增殖时具有致死的基因克隆。

2.    扩增大片段(100kb)外面DNA载体。



严谨型复制/松弛型复制


我们知道质粒是独立于细胞或细菌外能够进行自我复制的DNA。

那么当细菌或者细胞增殖的时候,质粒是如何复制的呢?

前面介绍到复制子决定了质粒的拷贝数,调节pMB1质粒复制子的是一种RNA分子,通常具有比较高的拷贝数,其复制的时候不需要自身合成蛋白,并且完全依赖宿主细菌或细胞提供的蛋白质,这一类就是“松弛型”的复制,即使宿主挨饿受冻,它依然不停复制。

与之对立的是严谨型复制,像pSC101这一类的质粒需要自身合成RepA蛋白,一旦细胞蛋白质合成受阻,拷贝数就不能增加。



质粒的不相容性


通俗来说,就是一山不能容二虎。作为科学来说,我们需要一个严谨的定义

“利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向自细胞的分配过程中彼此竞争,这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处,这种现象诚挚为不相容性”。

这样来说的话,是不是相同复制子的两个质粒就能共存了?

是这样的,但是假设有两个相同复制子的质粒A和B,A比较大,复制一次需要1h, B比较小,复制一次只需要20min,那么在多次增殖之后,B会占据绝对优势。

那么,是不是相同复制子并且大小一致的两个质粒就能一直共存了?

错误,即使A和B相同的复制子,相同的大小,也不一定是一致的。你肯定看过如下的图片:

下载.jpeg

一旦某一个质粒优势建立起来,经过几代培养之后,另外一个质粒就丧失完全。



压力选择


我们构建的质粒中一般带有某种抗性基因,比如氨苄。通常我们在大提质粒的时候往培养基里加入一定浓度的抗生素,一方面是为了抑制其他细菌的增殖,另外一方面还可以提高细菌中质粒的浓度。

抗生素对于细菌来说是致命的啊,你想现在细菌中出现了一个能够帮细菌抵抗抗生素的战士,那细菌还不得拼了命地保持更多的质粒。

有一种载体是受温度调控的,叫做失控复制的质粒载体,在某一温度下(比如34度)是以正常的方式复制,随着温度升高拷贝数越来越多,反过来多的拷贝数的产物蛋白对宿主生长影响很大。因此选择一个诱导的时间对于获得大量的产物是非常重要。



如何读懂一个质粒


如何读懂一个质粒,我们以一个例子说明:

下载 (1).jpeg

  1.  首先看复制起点Ori. 了解质粒是原核质粒/真核质粒/穿梭质粒。真核生物DNA复制起始点有多个,原核生物复制起始点只有一个。上图中pEGFP-C3是一个穿梭质粒,穿梭质粒是指可以在多种宿主下复制。Neor是真核抗性,Kanr是原核抗性,所以pEGFP-C3可以在大肠杆菌和酵母真菌中用不同的抗性药物筛选。

  2. 抗性。抗性便于后期筛选,比如氨苄(Amp),氯霉素(cam),四环素(Tet),潮霉素(Hyg)等。上图中抗性为Neo/kan两个抗性。

  3. 多克隆酶切位点MCS。我们目的片段就是要插入这些多克隆酶切位点中间。

  4. 看是否含有表达系统原件,即 启动子-核糖体结合位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。




质粒图谱哪里去找?


    当然首选Addgene,Addgene是一个非营利性机构,收录了最全的质粒库,网址:http://www.addgene.org , 每个质粒的详细情况罗列的非常清楚

下载 (2).jpeg


没有账号?