科研星球

导师再也不用担心我的IP / Co-IP的条带了

IP实验分成两个部分(免疫沉淀IP+WB)


 

免疫沉淀(IP)部分:在含A蛋白细胞裂解液中加入A蛋白抗体(IP抗体),再加入琼脂糖珠/磁珠,形成“A蛋白+IP抗体+磁珠/琼脂糖珠”复合物,通过离心沉淀或使用磁力架吸附,把复合物提取出来。

 

WB部分:首先把IP沉淀下来的复合物蛋白给煮了,制备跑胶样品!  在煮的过程中,IP抗体会断开成为重链+轻链。SDS-PAGE电泳时,重链,轻链,A蛋白一起出现!所以IP实验WB跑出来的条带是三条带!

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当IP抗体和WB抗体使用同一个,或者是同一个来源(比如兔)。由于SDS-PAGE上的重轻链也是兔来源的,所以当使用抗兔的二抗孵育时。目的蛋白和重轻链片段全都结合上了抗兔的HRP二抗,因此ECL发光后就出现3条带!

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所以理论上只要选择两个不同来源的抗体,就可以避开抗体重链和轻链的干扰!

那如果正好木有不同来源的一抗怎么办?


是时候拿出压箱底的二抗了,只结合“重轻链”在一起的二抗,特异性地识别结合在一起的重轻链!

 


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