Western Blot操作步骤多，每个细节的差错都会造成图片不理想，那么怎么跑出漂亮的Western Blot图片？如果你的蛋白分子量大于150KD，但苦于一直跑不出好看的western-blot，那么这篇文章，你一定得看。关注这五个步骤细节，教你跑出漂亮的大分子western-blot图，童鞋们赶紧来围观吧！
选对凝胶很重要
3种最常见的凝胶包括Tris-Glycine, Bis-Tris and Tris-Acetate. Tris-Glycine凝胶的PH为8.6，且保质期很短。在跑胶的过程中，PH还有上升的趋势，可达到9.5。这会导致蛋白降解和低分辨率。
Bis-Tris凝胶的PH为6.4，相对Tris-Glycine凝胶，稳定性和保质期都有所增加。但这种凝胶需要在溶液中增加抗氧化剂，比如DTT，以维持蛋白的还原性。
Tris-Acetate 凝胶的PH为7，跑大分子蛋白会呈现很高的分辨率。跑大分子蛋白时，我们推荐使用Tris-Acetate 凝胶。
凝胶浓度很重要
既然选择了Tris-Acetate 凝胶，还有几个要考虑的问题。凝胶浓度与孔径成反比：浓度越小，孔越大。较大的蛋白质更容易通过较大的孔，所以我建议使用低百分比的凝胶，如7％。可以使用梯度凝胶或非梯度凝胶，梯度凝胶非常适合新样本。
提高转移buffer中的SDS，减少甲醇
转移buffer的组成至关重要。如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。通过减少转移buffer中的甲醇百分比（10％或更低）来避免这种情况发生。为了进一步确保蛋白质不会沉淀，考虑添加SDS至终浓度为0.1％。SDS向蛋白添加均匀的负电荷，使得它们更容易从凝胶转移到膜上。
选择合适的膜
膜一般有PVDF膜或NC膜。跑大分子蛋白选择PVDF膜。如前面所说，如果有甲醇存在，大分子蛋白很容易沉淀。而PVDF膜不需要在转移buffer中添加甲醇，目的蛋白转印的机会更高。两种类型的膜都有各种孔径尺寸，最常见的是0.2um和0.45um。与凝胶一样，较大的蛋白比较小的更容易穿过大孔隙。大多数蛋白质（> 20kDa）可以用0.45um膜转移，避免使用0.2um孔径。
增加转印时间
在正确的选择完凝胶、转印膜及转移buffer后，转印正式开始。半干转快且方便，但不适用于大分子蛋白。我建议湿转，因为大分子蛋白转移时间很慢，推荐350-400 mA转移90min或 4°C，40 mA，转印过夜。
