皮肤覆盖全身表面，是人体最大的器官之一，可分为表皮与真皮两层，并借皮下组织与深层组织连接。表皮位于皮肤浅层，由角化的复层扁平上皮组成。细胞主要分为两类：一类是角质形成细胞，约占表皮细胞的80%以上，且分层排列；另一类细胞为非角质形成细胞，数量较少，散在分布于角质形成细胞之间。真皮位于表皮下，主要由致密结缔组织组成，有许多弹力纤维和胶原纤维，故有弹性和韧性。真皮是皮肤内发生免疫反应的主要部位，参与免疫反应的细胞包括树突状细胞、T细胞、内皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞等。

在皮肤中细胞之间的连接主要通过桥粒与半桥粒连接，富含胶原纤维和弹性蛋白。因此在皮肤组织的解离过程中我们选择使用DispaseⅡ和胶原酶Ⅳ。DispaseⅡ为中性的蛋白酶，可水解纤连蛋白和IV型胶原蛋白，具有切割亮氨酸-苯丙氨酸键的特异性；该酶非常温和，不会对细胞膜造成损伤。

皮肤组织

皮肤组织示意图

实验仪器及耗材

实验步骤

1. 皮肤组织放置在4℃ 预冷的1×DPBS溶液中进行清洗，剔除非目标组织成分。

2. 将皮肤切成0.5cm³大小的颗粒，清洗去除碎屑。

3. 在皮肤表皮层厚度200μm的地方开一个小口，有助于酶解液的渗入。

4. 将处理好的皮肤组织放进含有50mL RPMI + 2U/ml disase II的离心管中。

5. 封口膜封住管口，将含有酶解液和皮肤组织的离心管置于37℃，60rpm/min的水浴锅中进行消化。

6. 37°水浴 1 小时，期间每10分钟翻转离心管一次，以确保皮肤充分接触解离液。

7. 1小时以后使用1×DPBS润洗以去除第一轮酶解液。

8. 使用镊子和锋利的刀片将表皮从真皮层剥离，剥离时在冰浴的1×DPBS中操作。

9. 将表皮置于含有20ml RF10 （RPMI + 10% FBS  + 1% Penicillin-Streptomycin + 1% L-Glutamine）的细胞培养皿中。加入1.6 mg/ml胶原酶；将其放入37℃，5% CO₂培养箱中过夜或者超过12小时孵育。

10. 对真皮细胞重复操作9。

11. 使用移液管收集上清并用孔径100μm的过滤器过滤，收集真皮和表皮中的细胞。

12. 用RF10溶液润洗细胞培养皿以获得残留的细胞，收集到的溶液通过40μm细胞过滤器过滤。

13. 收集到的细胞悬液，通过400g，离心5分钟，离心收集，弃上清后用1×DPBS重悬细胞。

14. 通过细胞计数仪检测细胞活性大于等于85%，背景干净，结团率小于5%，细胞量大于等于5万；可用于后续单细胞测序建库实验。

制备结果

注意：皮肤细胞悬液制备中容易出现结团率偏高的情况。我们可以通过DNAseI和其他类型胶原酶辅助解离降低结团率，或者通过结团细胞团和单个细胞间沉降系数差进行离心沉降，从而获取低结团的细胞悬液。再者需要保证足够的解离时间，解离时间较短或者机械辅助不足时获取的角质层细胞比例较高。