RAW264.7属贴壁细胞，最好的形态呈现为小而圆、透亮，但其也极易出现伪足的细胞形态，这也是大家细胞总是养不好、消化传代困难的根源，同时也是实验数据不理想的罪魁祸首。除此之外，细胞生长缓慢、贴壁困难，也是大家在养细胞过程中出现的最常见问题，今天就来给大家整理一份RAW264.7细胞培养的经验！！！
RAW264.7中文全名为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，来源于雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤，是常用的炎症细胞模型之一，常见于研究细胞吞噬、细胞免疫、分子免疫学。
RAW264.7细胞具有强吞噬能力，细胞在吞噬抗原后释放趋化因子，促使细胞分化出伪足，因此造成细胞极难消化。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都易促使细胞呈现梭形，造成最终实验数据不理想。
有时细胞看起来一切正常，但却生长缓慢，究其原因多半是感染了支原体，支原体感染导致生长变慢、状态变差，虽不会马上致死，但会影响其机体内的各种参数，且难以被观察到，是影响细胞状态的隐形杀手。
1、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。 2、每次传代都很难消化下来。用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。 3、RAW264.7细胞生长时喜欢结伴。正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。 4、RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时就能贴很多，刚贴壁是细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是提醒你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。
培养条件：90% alpha-MEM + 10% FBS；5% CO2 ，37.0°C传代条件：直接去除旧培养液，0.25% trypsin/EDTA消化3分钟，收集细胞离心去上清，加入新鲜培养液后用电动移液器吹落细胞，置于新dish中并补充适当体积新鲜培养液。1:3～1：6传代，约每天需传代一次（视细胞密度而定）。冻存条件：20%FBS的培养基+10%DMSO，4℃放置2小时，再将冻存管置于梯度降温冻存盒（Nalgene，如无此条件可用泡沫盒包裹）并放于-80度过夜，第二天转入液氮罐；复苏条件：迅速从液氮罐中拿出冻存管，37℃水浴锅孵育，复温后吸出细胞至15ml离心管，1：1缓慢加入培养液（如冻存管中1ml冻存液，则缓慢加入1ml培养液），离心去除培液后用新鲜培液重悬置于dish中培养。
在日常培养过程中发现RAW264.7细胞容易出现的问题主要为以下几种：1.复苏不易成功2.细胞形态变异明显3.消化困难4.细胞生长缓慢，当你的细胞培养遇到上述瓶颈，不妨试一试以下几种解决办法。
原因：RAW264.7对空间十分敏感，复苏密度太高，细胞增殖太快，加剧细胞营养缺失，加速细胞老化。
解决办法：T75培养瓶复苏细胞数量控制在104~105
原因：细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促使该细胞呈现梭形、长梭形
解决办法：改善细胞培养环境，例如与细胞接触的玻璃器皿均高温灭菌，换flask培养瓶，采用一次性器具，使用质量较高的胎牛血清
原因：细胞老化后，细胞伪足多且长，使细胞难消化，使用胰酶或细胞刮会对细胞损伤较大
解决办法：无需胰酶使用吸管重复吹打，可消化大部分正常状态的细胞；但若细胞为“长脚”状态，即使加入胰酶消化超过10min，也难以消化下来，勉强消化，对后续的实验数据也有较大影响。
原因：支原体污染会导致细胞生长缓慢，甚至难以贴壁
解决办法：定期进行支原体检测，如发现支原体污染，即刻使用支原体去除试剂
