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BCA法及Bradford法蛋白浓度测定的区别?

原理

BCA法原理:碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,吸光强度与蛋白浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。


Bradford法原理:考马斯亮蓝在酸性游离状态下呈棕红色,最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色,最大光吸收在595nm。在一定的浓度范围内,蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝结合,在2-5min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1小时内保持稳定。



选择区别

BCA法:该方法可以兼容样品中高达5%的SDS,5%的Triton X-100,5%的Tween 20、60、80。但该方法受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响,需确保EDTA低于10mM,无EGTA,二硫苏糖醇(DTT)低于1mM,β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。


Bradford法:该方法样品中β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol)的浓度可高达1M,二硫苏糖醇(DTT)的浓度可高达5mM。但该方法受略高浓度的去垢剂影响,需确保SDS低于0.01%,Triton X-100低于0.05%,Tween 20、60、80低于0.015%。


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