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琼脂中如何进行克隆培养?

概要

温度高时琼脂呈液态,但在37℃时呈凝胶状态,细胞悬浮在温暖的琼脂凝胶培养基中,待琼脂形成凝胶后进行培养,形成散在集落,很容易分离。


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图1 琼脂中的悬浮克隆培养。培养的细胞或取自骨髓或肿瘤的原代悬浮细胞,悬浮于其后形成凝胶的琼脂或低熔点的琼脂糖中,形成悬浮的克隆集落。为了防止细胞与培养皿底部黏附,需要铺一个底层。

(a)制备琼脂底层,55℃的1.2%琼脂与37℃的2×培养基混合后,立即加到培养皿中。在室温或4℃条件下待其形成凝胶;

(b)琼脂培养基的制备。1.2%的琼脂和UPW均在55℃与2×培养基混合,制备0.3%的克隆培养用琼脂。若使用低熔点的琼脂糖,所有溶液均可保持37℃,但是这种琼脂糖形成凝胶会更困难;

(c)悬浮培养的细胞、来自骨髓的细胞或是胰蛋白酶消化的单层培养细胞进行计数和系列稀释,最终用琼脂或琼脂糖稀释,接种到底层琼脂上



材料

无菌

*Noble琼脂,Difco

*两倍浓缩培养基(即Ham’s F12、RPMI1640、DMEM或CMRL1066)。用10x培养基配制2x培养基,取半量所需终液量,加两倍浓度的血清

*胎牛血清(需要的话)

*生长培养基,1×,用于细胞稀释

*无菌超纯净水(UPW)

*无菌锥形瓶

*吸管,包括用于吸取琼脂溶液的一次性无菌塑料吸管

*通用容器,小玻璃瓶或者离心管,稀释细胞用

*3.5cm培养皿,非组织培养级 

非无菌

*本生煤气喷灯和三角瓶

*55℃水浴

*37℃水浴

*电子细胞计数仪或血细胞计数板

*托盘


注意事项  

准备培养基和细胞之前,先算出细胞稀释度,在培养皿上做好标记,检测一个细胞系的克隆形成率时,为每种稀释度的细胞分别准备3个培养皿。每个3.5cm培养皿适宜接种的细胞数是1000、333、111和37个,也就是依次3倍地稀释细胞悬液。如果需要加入生长因子、激素或其他添加剂,应加在下层的0.6%琼脂中。 



操作步骤

1.在培养皿底皿的侧面编号或做好标记,将培养放在托盘中,很方便。


2.准备含40%FBS的2×培养基,保持37℃。


3.称取1.2g琼脂。


4.分别在无菌锥形瓶和另一个无菌瓶中加100mL无菌UPW。将1.2g琼脂放入锥形瓶中,盖好,煮沸2min。另一种方法是,提前高温灭菌琼脂。但若保存起来,使用时仍需煮沸溶解或微波炉融化备用。

5.将煮沸过的琼脂和有UPW的瓶放到55℃水浴中。


6.2×培养基和1.2%琼脂等量混合制备0.6%琼脂底层(图2),保持37℃。如果需要任何的生长因子、激素或其他添加物,应在此时添加至底层琼脂培养基内。

7.在培养皿中加入1mL0.6%的琼脂培养基,摇匀,确保培养基覆盖整个培养皿底。置于室温定型(图1a)。


8.制备细胞悬液,计数(图1c)。


9.准备0.3%琼脂培养基,保持37℃。此培养基可以用37℃的2×培养基、55℃1.2%琼脂和55℃的UPW以2:1:1的比例混合制备(图1b)。


10.制备以下稀释浓度的细胞,使细胞的最大浓度为1×105/mL

(a)1×105个/mL;

(b)将1×105个/mL稀释3倍成3.3x104个/mL;

(c)将3.3×104个/mL稀释3倍成1.1×104个/mL;

(d)将1.1×104个/mL稀释3倍成3.7×103个/mL。


11.将4种稀释液的浓度分别标在4个小玻璃瓶或试管上,从每种稀释液中吸出40μL,包括1×105/mL细胞液,分别放入相应容器内,37℃加4mL0.3%琼脂培养基,混匀,再从每个容器中吸出3个1mL分别加在相应的3个培养皿上(图1)。最终浓度如下(每皿):

(a)1×103个/mL;

(b)330个/mL;

(c)110个/mL;

(d)37个/mL。


注意事项  加细胞之前,确保上层琼脂培养基有足够的时间冷却至37℃。


12.待培养皿中的溶液在室温下形成凝胶状态。


13.将培养皿放置在一个带盖的清洁塑料盒中,37℃加湿温箱中培养10天。

图片


来源于《Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications

R.lan Freshney  著 


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