在磷酸化蛋白检测中,有哪些常用的刺激手段?主要包括:缺氧诱导、DNA损伤诱导、AMPK激活、PKC激活,磷酸酶抑制、mTOR抑制以及PI3K抑制等。
1.Cobalt Chloride刺激模拟缺氧环境 缺氧环境下,很多蛋白的磷酸化水平会发生明显变化,而Cobalt Chloride(氯化钴,CoCl2)则可用于模拟细胞缺氧环境。 一方面Co2+通过直接取代类血红素中的Fe2+使其不能与O2结合而保持脱氧状态,模拟缺氧;另一方面,Co2+会置换脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶催化基团上Fe2+,进而抑制缺氧诱导因子(HIF-1)的降解,HIF信号通路被激活。(注:实际使用缺氧条件处理细胞时,一般采用缺氧培养箱,通过控制N2、CO2、O2三者的比例来达到缺氧或低氧环境。) 不过需要注意的是,CoCl2处理并不能完全替代缺氧条件。在CoCl2处理和正常缺氧环境下,STAT3的磷酸化水平显示出不一致的趋势。 (图片源于参考文献 1) 2.Etoposide、MMS诱导DNA损伤 Etoposide是抑制拓扑异构酶(Topoisomerase Ⅱ ,TOP Ⅱ) 的抑制剂。它能与TOP Ⅱ和DNA形成复合物来阻碍DNA的修复,造成DNA损伤。 ATM对DNA损伤作出反应,发生Ser1981自磷酸化。CHEK2作为ATM的底物,在Thr68位点被磷酸化并激活,进而磷酸化下游p53的Ser15位点,这一系列反应会使细胞停滞在G2/M时期。Etoposide(商品名依托泊苷)对癌细胞也具有杀伤作用,是一种抗肿瘤药物。 类似造成DNA损伤的还有MMS(甲基磺酸甲酯),MMS是一种烷化剂,也是一种潜在的致癌物。 (图片源于:Proteintech) 3.AICAR激活AMPK级联通路 AICAR是一种腺苷类似物。它由腺苷转运蛋白转入细胞,被腺苷激酶磷酸化后形成ZMP。ZMP可模拟AMP对AMPK及AMPKK的激活。因此它属于AMPK激活剂。高浓度的AICAR会促进细胞凋亡。 (图片源于参考文献 2) 4.Forskolin激活cAMP信号 Forskolin(毛喉素)是毛喉鞘蕊花中分离的二萜类化合物。因其属于脂溶性化合物,能穿透细胞膜刺激腺苷酸环化酶,属于腺苷酸环化酶的激活剂。它对腺苷酸环化酶的激活导致细胞内cAMP显著增加,cAMP作为第二信使激活下游通路,导致多种蛋白的磷酸化水平发生改变。如Forskolin处理细胞增加了cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化。 (图片源于Proteintech) 5.PMA激活PKC途径 PMA又称TPA,是一种广泛用于体内外实验的佛波酯类PKC(蛋白激酶C)激活剂。PMA可以结合PKC,并激活PKC,随后导致一系列的细胞响应。PMA通过PKC途径激活也能促进CREB磷酸化。另外PMA处理还会激活THP-1细胞,诱导其分化为巨噬细胞。 6.BMP-2/Smads通路激活 BMP-2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一,其在体内以自分泌和旁分泌的形式诱导骨、软骨及骨相关结缔组织的形成。 BMP-2含有两种受体(BMPRs),均具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,可以直接作用并磷酸化下游的Smads,磷酸化的Smads从细胞质转移到细胞核,调控基因转录。 (图片源于参考文献 3 和Proteintech) 7.Staurosporine抑制蛋白激酶(PKs)活性 星形孢菌素(Staurosporine)是从细菌中分离出来的一种天然生物碱,是一种ATP 竞争性蛋白激酶抑制剂,可抑制PKC、PKA等蛋白激酶活性。 用Staurosporine处理SH-SY5Y细胞,它能通过半胱天冬酶依赖性/不依赖性途径引起细胞死亡;在细胞周期检测中,0.5nM Staurosporine有效地将细胞阻滞在G2/M期。 8.Nocodazole抑制微管聚合 诺考达唑(Nocodazole)是一种微管聚合的可逆抑制剂,它能诱导细胞凋亡和细胞周期停滞(G2/M期),实验室常用Nocodazole处理细胞,同步细胞周期到有丝分裂期。 Bcl-2蛋白是微管损伤剂的靶标。Bcl-2会被JNK磷酸化,被SAPK失活。细胞在同步到有丝分裂时ASK1被激活。ASK1又分别通过MKK3/MKK6和MKK4/MKK7的磷酸化激活p38和JNK。 (图片源于参考文献 4) 9.Rapamycin抑制mTOR信号 雷帕霉素(Rapamycin)是一种mTOR抑制剂,它能与FKBP12结合形成复合物,该复合物结合并特异性地充当mTOR复合物1(mTORC1)的变构抑制剂。 (图片源于Proteintech) 10.LY294002/Wortmannin抑制PI3K/AKT通路 LY294002是由人工合成的吗啉衍生物,也是一个常用的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂,能够抑制PI3K/AKT通路,抑制AKT的磷酸化。LY294002还可以减少癌细胞增殖和增加细胞凋亡,因此具有体外抗癌活性。 渥曼青霉素(Wortmannin)与LY294002功能类似,也是一种有效的PI3K抑制剂。 11.Calyculin A抑制磷酸酶(PPs) 花萼海绵体诱癌素A(Calyculin A)最初是从海绵中分离得到的一种海洋毒素,是一种有效的蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制剂,对酸性或碱性磷酸酶及磷酸-酪氨酸蛋白磷酸酶等无抑制作用。 12.Okadaic Acid抑制磷酸酶(PPs) 冈田酸(Okadaic Acid)也是一种磷酸酶抑制剂。与Calyculin A不同的是,它对PP1的抑制性较弱。 用10nM Calyculin A处理MCF-7细胞2h,能抑制超过50%的PP1和PP2A活性;但用1μM Okadaic Acid处理MCF-7才能达到10nM Calyculin A处理的效果,并且PP1活性几乎不受影响。 (图片源于参考文献 5)
【参考文献】