01 复 苏 细胞复苏的原则：快速融化 必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 实验前准备 将水浴锅提前预热至37℃。 细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。 取出冻存管 根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。 从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 迅速解冻 迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 平衡离心 用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。 制备细胞悬液 吸弃上清液。 向离心管内加入适量完全培养液，吹打制成细胞悬液。 用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。 细胞计数 细胞浓度以5×105/ml为宜。 培养细胞 将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4h（或者24-48h）后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。 记录复苏日期 结果分析 判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞，台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率。呈蓝色的细胞为死细胞，活细胞不着色。用细胞计数板和计数器计数细胞，得出细胞存活率）。 如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。 ×× 初学者易犯错误 ×× 水浴锅未提前预热或者未预热到37℃直接融化。 水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
02 传 代 如何确定细胞的正确初始接种密度? 美国细胞库（ATCC）建议各类不同细胞株接种密度： https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx细胞类型 接种密度 常见肿瘤细胞株 2-4 x 106 viable cells/25cm2 成纤维细胞株 2-4 x 106 viable cells/25cm2 淋巴细胞/悬浮细胞 3-4 x 105 viable cells/ml 杂交瘤 2 x 105 viable cells/ml 成肌细胞 1-2 x 104 viable cells/cm2
03 冻 存 细胞冻存的基本原理：慢冻 手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。 程序降温盒：是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。 由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。 不需要任何特殊器皿 受控速率冻结装置 适当的存储瓶 专门的冷冻溶液 -80℃冷冻机 大家可以根据自身情况或者实验条件选择不同的冻存方式。 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，可以长期保存。 因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。 如何选择冻存液 首先我们需要明确首要任务是什么？我们的细胞需要什么？ 高回收率？ 高存活率？ 注重低温保存培养基成分？ 需要无血清或无外源性要求？ 商业培养基相比于自制培养基的优势？程序降温 手动降温 优点 主动监控温度
一些控制速率的冷冻机不需要任何可消耗的制冷剂缺点 长时间保存 液氮或低温储存（只要低于-135℃即可） 液氮
