蛋白酶体及其抑制剂

蛋白酶体是蛋白质合成过程中错误折叠的蛋白和其他蛋白被proteolyzed的主要降解途径。它存在于所有的真核细胞、古细菌和一些细菌中，是一种具有多重催化活性的蛋白酶，由多个催化和调节蛋白组成。它具有三到四个不同的肽酶活性，包括类胰蛋白酶，类胰凝乳蛋白酶以及peptidylglutamyl-多肽的水解活性。根据沉降系数的不同可分成两种类型的蛋白酶。其中26S蛋白酶体的相对分子质量约2000 kDa，依赖于ATP；而20S蛋白酶体相对分子质量约750 kDa，不依赖ATP。大多数蛋白质在被蛋白酶体降解之前需要泛素化。

蛋白酶体抑制剂已被用于疾病，如癌症的治疗药物，在实验室研究中也有广泛的应用。硼替佐米，也被称为PS-341，万珂，或者MG-341，是一种FDA批准的多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤治疗药物。它也可以用于在实验室研究中，用以抑制蛋白酶体的活性 [1] 。一些其他蛋白酶抑制剂也已被开发为药物或正在临床试验和测试阶段，它们包括双硫仑、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、Salinosporamide A、carfilzomib、ONX0912、CEP-18770以及MLN9708。

MG132

MG132，又称苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-leucinal，Z-LLL-CHO，是一种肽醛，能够抑制不同类型蛋白酶的活性，包括丝氨酸蛋白酶、钙蛋白酶等的一种化学物质。MG132和其他肽醛可以有效抑制蛋白酶体多个肽酶的蛋白酶活性，并能抑制钙蛋白酶的活性

蛋白酶体是细胞功能不可分割的一部分。MG132，跟所有其他蛋白酶体抑制剂一样，对细胞和组织是有毒的，使用浓度过高或治疗时间过长会导致细胞死亡。可取的做法是选择稀释1000倍范围的最适浓度。最适浓度不仅与细胞类型有关，也取决于细胞培养参数如细胞饱和度，血清浓度，培养基成分。

MG132应储存在-20℃，可溶于DMSO（10mg/ml）、甲醇（1 mg/ml），并可分装后分别存储在-20℃或-80℃。在加入培养基中时如果MG132的DMSO溶液产生沉淀，DMSO原液可以加热至40℃。

乳胞素

乳胞素是一种从链霉菌中分离的抗生素，现在可以化学合成。它在细胞内和体内可水解成clasto-lactacystinβ-内酯，它可能是通过共价修饰哺乳动物20S蛋白酶体X亚基N-末端的苏氨酸活性发挥抑制作用。这一共价结合是高度特异的，因此它不影响半胱氨酸或丝氨酸蛋白酶活性，而更像是通过类似MG132那样的肽醛发挥作用。

乳胞素已被用于细胞培养中，10 uM, 25 uM浓度下作用数小时。

其他蛋白酶体抑制剂

蛋白酶体抑制剂I

Calbiochem 公司的蛋白酶体抑制剂I (PSI)被用于孵育转染细胞 , Peptide Institute的 蛋白酶体抑制剂I PSI (N-苄氧羰基-L-异亮氨酰-L-γ-叔丁基-L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-亮氨酸) 被用来处理细胞 

PS-341, MG-341, 万珂(Velcade)

万珂（同PS-341，MG-341）被用于实验室实验中，用来抑制蛋白酶体的活性  。万珂的细胞毒性已有研究。 用50 umol/L 的万珂处理HEK-293细胞8小时未发现明显的细胞死亡。用0.5〜50μmol/ L的万珂延长培养（24小时）则会导致约40％的细胞死亡 。

蛋白酶体抑制剂的验证

在使用蛋白酶体抑制剂的过程中一个很重要的问题是确保蛋白酶体活性确实衰减了。有几种方法可用于验证抑制效果。其中一个简单的方法是用Suc-LLVY-AMC（N-琥珀酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酰-7 - 酰氨基-4 - 甲基香豆素）作为蛋白酶体活性荧光指示剂 。另一种方法是用western blot检测单聚和多聚泛素亚单位的比例。蛋白酶体活性如果被抑制，单聚泛素的水平会偏低。