一、什么是引物

弓|物是人工合成的两个寡核苷酸序列:一个引物与靶区域-端的一条DNA
模板链互补,另一个弓|物与靶区域另一端的另-条DNA模板链互补,其功能是作
为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3 '端开始合成新的核酸链。

二、引物的作用

DNA聚合酶在PCR扩增过程中只能将新的脱氧核苷酸添加到已存在的3’端,与新的核苷酸的磷酸基团形成新的磷酸二酯键。引物的作用就是,在PCR退火过程中结合到正义链上，从而提供3’端羟基。

三、引物设计的原则

01、基本原则

①引物长度: 15-30bp，常用21bp左右。
②弓|物扩增的跨度:以200-500bp为宜，( 具体的长度根据实验目的设计)。
③G+ C含量以40%-60%为宜G+C太少 ,扩增效果不佳,太多易出现非特异性条带，ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免弓|物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体产生非特异的扩增条带
⑤引物3’端的碱基应该严格要求配对,特别是倒数第I二个碱基,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处(后续有详解)

⑦引物的特异性,引物应该与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
⑧引物量:每条引|物浓度0.1-0.5 μM以最低弓|物量产生所需要的结果为好,弓|物浓度偏高会弓|起错配和非特异性扩增,且可增加弓|物形成聚体的机会。

02、退火温度与时间
退火温度与退火时间取决于弓|物的长度,碱基组成及其浓度,目的基因的序列长度

03、引物的复性温度Tm=4(G+C)+ 2(A+T)
复性温度=Tm值-( 5-109c)
在TM值允许的范围内,选择较高的复性温度可减少弓|物和模板间的非特异性结合复性时间一般为30-60s。具体时间取决于扩增产物序列的长度

四、延伸温度与时间
①常用温度72°C ,过高的延伸温度不利于引|物和模板的结合,延伸反应时间根据待扩增片段长度而定。
②1kb内  的DNA的片段延伸时间  30-60s3-4kb  的DNA的片段延伸时间  3 -4min10kb_上的DNA的片段延伸时间  15min
③延伸时间过长会导致非特异性扩增，对低浓度模板的扩增延伸时间可稍长- -些 ,不同公司的Taq酶,扩增效率不-样,使用前应仔细阅读说明书。五、循环数
④循环数一般在30-40之间,次数越多非特异性产物的量亦随之增多

一、设计网站：

二、PCR扩增产物大小

以构建鼠源PCMV-TAG2B-gata4表达载体为例：一般构建一 个表达载体,我们需要根据实验目的是需要表达全长的蛋白还是其蛋白中的某一个结构域。 如果是全长,那么我们一般PCR引物扩增的跨度就是从转录起始子ATG到转录终止子TGA或TAA ,并且注意载体上的起始密码子需和CDs序列的ATG之间的碱基数目是3的倍数,以防移码突变,不编码目的蛋白。

一、如何查找鼠源gata4的CDs序列?

01、棕色底字体即为小鼠种属的CDs全长序列1以此序列为模板,将其输入至primer3.0中设计引物。

02、经过分析之后，第一引物最优，因此我们选择第一-对引物,但是,第一对引物的上游引物与转录起始位点ATG相距41bp,为非3的倍数,因此我们需要在弓|物序列之间增加一个碱基,使得上游弓|物与转录起始位点ATG相距42bp,为3的倍数。因此,最终引物为:

03、引物找到之后,还需要连接至载体上,所以最终的弓|物序列需要和载体有联系,能和载体有联系的那就是酶切位点。因此,我们需要将gata4CDs序列进行酶切位点分析,-般推荐使用NEBcutter V2.0

网址：http://nc2.neb.com/NEBcutter2/

04、选出一-些不能切目的序列的常见的酶,如方框内的酶

结合前面的的酶切位点分析以及载体上的酶切位点，我们选择BamHI和XhoI， 因此，选择这两个酶切位点的同源臂为:

F: GAT AAG AGC CCG GGC GGA TCCR: ATC GAT ACC GTC GAC GAG CTC

所以，经分析,构建鼠源PCMV-TAG2B -gata4的表达载体最终的引物序列为:

F: GAT AAG AGC CCG GGC GGA TCCgcattctagttcttgtctgcct
R: ATC GAT ACC GTC GAC GAG CTC agatttgaagagggaagg  政休刚增水eaddoene

以DNA为模板的qPCR弓|物比较好设计,跟普通引物的设计- -样, PCR产物长度最好在100-200bp之间。以cDNA为模板的qPCR引物设计需要排除基因组的污染,所以在设计的时候最好跨内含子,且跨的内含子长度越长越好。

为了使内含子和外显子的碱基数更加直观,我们一-般推荐使用ensemble数据库。下面以构建鼠源gata4基因qPCR弓|物序列为例进行介绍。

一、如何查找鼠源gata4的外显子序列打开ensemb|

网站: http://asia.ensembl.org/index.html

01、在搜索框中将物种选为Mouse ,输入基因名称gata4 ,点击Go。

02、如果是第一-次使用ensemble数据库,需要点击最下角的Configure page设置相应的参数

03、一般的 ,设计qPCR弓|物是要跨内含子,且跨得碱基数越多越好,像上图中,我们就可以选择2号外显子与3号外显子的碱基序列设计引物,设计的原则同普通PCR引物。