表观遗传学，包括DNA和RNA修饰，一直是后基因组时代生命科学领域的研究热点。其中RNA的化学修饰尤为复杂多样，迄今已鉴定出170多种。
近几年，由于表观转录组学的兴起，RNA的m6A修饰研究超级火爆，仅过去半年时间，相关文章高达929篇！竞争可谓激烈！
图1 m6A和m5C相关文章发表情况
数据截止2022年7月，源于PubMed
其实在m6A以外，还有另一种广泛存在的转录后调控方式——RNA的m5C甲基化修饰，虽然也引起了不少科学家们的关注，但发文量却仅为m6A的十分之一，一片“蓝海”。 今天，小P就带领大家认识一下m5C这个潜力新星。 1.m5C修饰简介 m5C修饰，即5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）修饰，存在于各种生物的mRNA、rRNA和tRNA中。 作为一种动态、可逆且分布较为广泛的表观遗传修饰，m5C修饰影响着许多RNA分子的命运，构成了应对内外部环境不断变化的有效多功能机制。已证实m5C修饰涉及调控细胞稳态、细胞应激、细胞毒性应激、肿瘤发生、肿瘤细胞迁移、胚胎发生，以及病毒复制、植物细胞发育和细菌耐药性等各个方面[1]。 2.m5C修饰对RNA的影响 2.1 m5C修饰对ncRNAs的影响 早期对m5C修饰在RNA中的研究主要集中于tRNA和rRNA上。 在tRNA中，m5C修饰促进碱基配对、控制翻译效率和准确性，调节tRNA稳定性，参与细胞代谢及应激反应[2]。小鼠tRNA-Asp中反密码子环上C38位点的甲基化可以促进含有多个Asp蛋白的翻译，以及保护tRNA免受应激诱导的内切酶介导的切割[3]；C48位点的甲基化则可以增强碱基对的疏水性并促进碱基堆叠，以增强蛋白的合成[4]。 图2 m5C在tRNA中的功能 源于[2] 在rRNA中，核糖体功能关键区的m5Cs修饰有助于保持其构象稳定。氧化应激条件下，酵母中的rRNA m5C修饰有助于rRNA折叠，促进mRNA的选择性招募和翻译，以参与不同的细胞信号途径[5]。 还有研究者对lncRNA上m5C的分布和调控进行了研究，结果发现m5C与lncRNA转录呈正相关，它还参与了lncRNA位点的长距离染色质相互作用，并且受不同m5C标记调控的lncRNAs与不同的肿瘤状态有关[6]。 2.2 m5C修饰对mRNA的影响 此前由于mRNA丰度较低，缺乏有效的分离纯化技术，因此研究相对较少。但随着近年来检测方法的进步，对mRNA m5C修饰的研究也逐渐多了起来。 在mRNA中，m5C修饰过程涉及多种酶和效应分子，包括NOP2/SUN RNA甲基转移酶2 （NSUN2）、NSUN6、tRNA天冬氨酸甲基转移酶1（TRDMT1）和Aly/REF输出因子（ALYREF）等[7]。m5C修饰的功能涵盖促进mRNA核质转运、病毒蛋白表达、DNA损伤修复、mRNA稳定、细胞耐受、增殖和迁移、发育、以及mRNA剪接调控等各个方面。 同时，m5C在不同细胞类型中的分布也不同，在mRNA不同特定位置的修饰表现出不同的调控活性，可以促进或抑制翻译[1]。因此，异常的mRNA m5C修饰与多种疾病的发生发展密切相关，包括癌症及多种自身免疫性疾病[8]。 3.m5C修饰的检测手段 作为一种与m6A十分相似的RNA甲基化修饰，二者的鉴定和检测方法也比较雷同。依托于高通量测序技术的发展和液相色谱灵敏度的提高，m5C修饰的主要检测方法包括： 1）物理化学方法，如色谱、质谱（MS）、高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS）； 图3 色谱法和质谱法检测m5C 源自[1] 2）化学转化法，通过结合下一代测序（NGS）技术，如RNA亚硫酸氢盐测序（RNA-BisSeq）和TET辅助的过氧钨酸盐氧化测序（TAWO-seq）等进行检测； 3）免疫沉淀与NGS技术相结合，如m5C单核苷酸分辨率交联与免疫沉淀(miCLIP)和5-氮杂胞苷介导的RNA免疫沉淀测序(5-Aza-seq)； 4）基于电信号差异的第三代测序（TGS）（Nanopore-seq）； 5）预测模型，如PEA-m5C、m5C-PseDNC、Pm5CS-COMP-mRMR和m5C-heuristic等。 图4 转录组测序法检测m5C 源自[1] 4.m5C修饰相关蛋白 RNA的甲基化修饰主要涉及三种类型的效应器：1)将特定的化学基团“写入”RNA的写入器（Writers），介导RNA的修饰；2)“阅读”这些RNA修饰的信息以维持RNA稳定，并参与核糖核酸翻译和剪接的阅读器（Readers）；3)“擦除”RNA修饰，并将其转换为未修饰的核苷的擦除器（Erasers）。m5C甲基化修饰也不例外。 图5 m5C修饰相关的效应子 源自[2] 4.1 m5C写入器 m5C甲基转移酶以腺苷蛋氨酸为甲基供体，通过将甲基转移到胞嘧啶形成m5C。 已发现的RNA m5C甲基转移酶有10多种，包括DNA甲基转移酶2（DNMT2）、tRNA特异性甲基转移酶(TRDMT)家族、NOL1/NOP2/SUN结构域(NSUN)蛋白家族。其中NSUN蛋白家族在人类中有7个成员（NSUN1-NSUN7）。 NSUN2的靶标范围相对比较广泛，在mRNAs、miRNAs和tRNAs的甲基化中发挥主要作用[9]。TRDMT1可催化tRNA中的m5C修饰，但与NSUN2有些许不同，TRDMT1的甲基化只在单个半胱氨酸位点上发生。 除此以外，还有研究表明拟南芥TRM4B也具有甲基转移酶活性，水稻OsNSUN2同样也具有甲基转移酶活性。 4.2 m5C阅读器 m5C修饰后的生物学功能实现，需要特定的识别蛋白识别并结合到修饰位点，引发后续的生物进程调节。目前，对于m5C阅读器的研究还处于早期阶段。 ALYREF是第一个在细胞核中发现的mRNA阅读蛋白，在mRNA的核质输出中起作用；它通过与具有m5C修饰的K171位点（171位点的赖氨酸）特异性地结合，调节mRNA的输出[10]；YBX1被鉴定为胞质中的mRNA m5C识别蛋白，通过YBX1冷休克结构域中的残基Trp45识别和结合m5C修饰的mRNA，参与维持m5c修饰mRNA的稳定性[11]；此外，RAD52对含有m5C修饰的RNA和DNA的杂交链有更高的亲和力，表明它是DNA损伤位点的m5C读取器，并且RAD52也能通过TRDMT1-m5C-RAD52-RAD51信号链来促进活性氧诱导的DSBs的非典型HR修复。 4.3 m5C擦除器 可逆的甲基化修饰是动态调节的基础，但目前对去甲基化酶（擦除器）的分类及定义还不是十分明确。 早期研究发现了一条与DNA m5C修饰相关的去甲基化途径，TETs作为双加氧酶将m5C氧化成5caC（5-羧基胱氨酸），然后被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶切割，从而完成DNA的去甲基化修饰。 Fu等人在RNA上也发现类似的进程：TETs在α-酮戊二酸及铁离子的协同下催化m5C转化为hm5C，hm5C进一步被TETs转化为5fC（5-氟胞嘧啶）和5caC，最后通过碱基切除修复途径将该位点转化为胞嘧啶，完成去甲基化[12]。 此外还有另一个DNA/RNA双加氧酶ALKBH1也被发现参与了tRNA的去甲基化[13]，并且ALKBH1的缺失导致线粒体翻译和耗氧量的严重不足，表明m5C可能在调节线粒体活性方面具有巨大的潜力[14]。 5.m5C修饰与癌症 近年来的研究发现，RNA的m5C甲基化修饰与多种疾病相关，尤其是肿瘤类疾病。 图6 m5C修饰异常与癌症 源自[2] Zhang等人发现肝癌组织中mRNA m5C甲基化程度明显高于癌旁正常组织，不同部位基因分布有显著差异[15]；He等人也表示NSUN4和ALYREF的高表达与肝细胞癌患者预后不良相关，虽然具体的潜在机制尚不清楚[16]。 Mei等人报道NSUN2在胃癌组织中的表达也明显高于癌旁的正常组织，并可能通过抑制p57Kip2的表达以m5C依赖的方式促进胃癌细胞的增殖[17]。Chen等人证明YBX1可以识别m5c修饰的mRNA，并招募ELAVL1来稳定HDGF mRNA，最终促进膀胱癌细胞的增殖和转移[18]。 还有研究显示，m5C修饰水平低的甲状腺乳头状癌(PTC)患者静息状态下的CD4+记忆性T细胞和CD8+T细胞较高，预后较好；而m5C修饰水平低的PTC患者中，活化的NK细胞和单核细胞大多较丰富，预后较差[19]。 图7 m5C修饰异常与癌症 源自[2] 以上案例，都是m5C参与癌症的一些证据和线索，m5C修饰和它的效应物，如NSUN2和YBX1等，可能将为疾病治疗提供新的靶点和方向，在癌症的诊断、治疗和预后上提供帮助。 6.m5C修饰研究展望 总体而言，m5C作为众多RNA修饰中的一种，已经渐渐引起了人们的关注。部分先行的科学家们，在该方向上取得了一些成果：发现了十数种m5C修饰相关蛋白，揭示了m5C修饰对mRNA和非编码RNA的影响，同时也探索了m5C修饰在疾病尤其是癌症中的作用。 但相较于m6A而言，m5C修饰相关研究才刚刚起步。基于二者已有的研究成果对比，未来m5C相关研究可能会在以下方面形成突破： 1）更多m5C修饰的写入器、阅读器、擦出器揭示。某些m5C位点在NSUN2基因敲除或敲除细胞系中仍然能够保持高甲基化水平，并且这些m5C位点与依赖于NSUN2的m5C位点具有不同的序列和结构特征，这表明存在未知的甲基转移酶参与了m5C位点的催化作用。 2）m5C与m6A等修饰之间的相互作用。在氧化应激诱导的细胞衰老过程中，NSUN2介导的m5C和由METTL3/METTL14介导的m6A在翻译水平上相互促进并协同增强p21的表达，证明了不同修饰之间互作的可能性。 3）m5C修饰调控癌症进程的详细分子机制。很多已有证据表明m5C修饰或m5C修饰相关蛋白参与到肿瘤发生的各个阶段中，但是m5C在其中是否占据主导作用，以及其调控的详细通路都有待进一步挖掘。 4）m5C修饰在非肿瘤性疾病中的作用。目前针对m5C与疾病相关的研究，绝大部分都集中在肿瘤上，非肿瘤性疾病很少，因此在未来的研究中拓宽m5C修饰相关疾病类型，也是一个不错的探索方向。 5）m5C和相关蛋白作为疾病诊断/治疗靶点。上面提到部分癌症中，m5C修饰水平和NSUN2等蛋白水平在不同部位、不同人群中的分布呈现一定的规律，这也暗示了m5C和相关蛋白可能会成为疾病诊断和治疗的新靶点，通过靶点的情况给疾病和患者分型，通过靶点的抑制剂或激活剂干扰疾病的进程。
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