RNA-seq是转录组研究的一项重要技术方法，自从它诞生以来，已经发展了上百种分析工具。人们往往更加热衷于对新的分析工具的开发，而忽视了对已有工具的系统性整合。近期在NC上发表了一篇通过对RNA-seq广谱性分析文章，获得对转录组数据更加全面的认识。

 期刊名：Nature Communications      

发表时间：2017年7月    

影响因子：12.124

RNA-seq技术的广泛应用为转录组研究迎来了一个新时代。根据研究内容的方向，精度、速度和成本要求不同，科研人员需要对包括采取何种具体测序方法流程、样品类型、所需的分析结果，以及基因组研究现状和计算数据处理可用资源等内容进行权衡。因为涉及的问题复杂多样，如何找到一种最佳的工作流程，在成本和性能要求基础上，通过对RNA-seq分析中涉及到的各个不同环节进行最优选择，便成为是至关重要的问题。

为了解决上述问题，研究者提出了一个综合性RNA-seq方案 — RNA-Cocktail法，这种方法分析了一系列RNA-seq工作流程，除了分析RNA表达情况之外，研究者还对RNA变异识别、RNA编辑和融合检测方法进行了评估。他们利用39个分析工具，对生殖系、癌症和干细胞的15个样本数据集进行了120个组合的490项分析，实现了工作流程的更高精度化，提供了更多生物学相关预测。

流程代码下载网址：http://bioinform.github.io/rnacocktail/。

 图1、RNA-Cocktail分析设计方案

 图2、不同序列比对策略性能比较

研究者比较了TopHat、STAR14和 HISAT2三种最常用的拼接软件，最终从整体的比较结果看，HISAT2比STAR14和TopHat分别快了大约2.5倍和100倍（图2）。

之后，研究者又比较了Cufflinks和StringTie这两个常用的基于比对的转录组工具，结果发现虽然Cufflinks在基因层面的检测要比StringTie灵敏一些，但是StringTie比Cufflinks多预测50–200% 的转录本，并且比Cufflinks分析速度快约60倍。

当缺少参考基因组或者转录组数据时，测序reads的de novo组装可以被用来构建转录本。本研究分析了三种广泛应用的工具：Trinity、Oases和SOAPdenovo-Trans。对RNA-seq数据的分析结果发现，Oases在所有样本中，具有最高的N10到N50值，表明它具有发现长转录本的优势（图3）。在对ExN50的测试中，Oases同样具有更有效的捕捉低表达基因的能力。而考虑到较低内存配置及计算需求时，SOAPdenovo-Trans则是最为高效的方法。

图3、不同de novo转录本组装技术性能比较

RNA-seq的一个重要目标就是鉴定不同样本和条件下基因表达差异情况，人们开发出多种检测方法，比如DESeq2、limma、edgeR、Cuffdiff、Ballgown和sleuth等。这些工具用于检测SEQC样品中的1001个表达差异基因的性能差异，结果表明，DESeq2较为明显的优于其他方法（图4）。

图4、不同基因表达差异工具性能比较

除了检测差异表达信息之外，RNA-seq数据还可以用于鉴定基因组和转录组重要的变异情况。

 图5、不同变异识别（a-c）、RNA编辑（d-e）和RNA融合（f）检测方法比较

在变异识别中，常用到SAMtools mpileup和GATK’s HaplotypeCaller工具。通过与其他环节多种工具的组合对比发现，SAMtools和GATK具有较为类似的处理时间和性能。RNA编辑作为转录后调控的重要过程，可以影响序列功能及表达水平，本研究重点对GIREMI工具进行了分析。RNA-seq的另外一个重要应用就是对融合基因的检测，比较常用工具JAFFA、 STAR-Fusion、TopHat-Fusion、FusionCatcher和SOAPfuse，以及长片段工具IDP-fusion和Iso-Seq的结果发现，FusionCatcher和IDP fusion表现出更高的灵敏性和准确性（图5）。

 图6、RNA-Cocktail流程图

综合上述工具比较分析结果，研究者对各个环节表现更好的工具进行整合，提出了RNA-seq分析高准确性工作流程—RNA-Cocktail（图6）在数据验证后发现，该流程优于之前的其他工作流程，如Galaxy和Grape等方法。