• 剂量反应案例研究：四参数Logistic 模型（4PL）

• 确定并对比有无增强剂条件下的EC50值

• Graphpad Prism 统计分析 数据分析 医学作图 绘图软件

在试验开始之前，我们先来看看什么是四参数 Logistic 模型（4PL）。

四参数 Logistic 方程有如下两种形式：

1）一种是浓度 X 已经用以 10 为底的对数做了变换； 
Model
Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))

2）一种是 X 没有变换过。对于任何一种方式，Prism 中的参数估计值、标准误和置信区间都是相同的；
Model
Y=Bottom + (X^Hillslope)*(Top-Bottom)/(X^HillSlope + EC50^HillSlope)

该模型中的四个参数包括：Top, Bottom, Hill Slope, EC50。

• Top 是指最大响应。 在这项试验中，研究者认为高浓度时约为 400。这相当于杀死的 80% 的跳蚤。

• Bottom 是指基线响应。 在浓度为零的情况下，研究者预测被杀死的跳蚤约为 0。

• Hill Slope 是指曲线的坡度。 大于 1 的值表示呈陡坡，小于1的值表示呈缓坡。某些时候，它被设置为 1。

• EC50 是指 Top 和 Bottom 之间引起反应的剂量。如果增强剂有效，「有增强剂」的 EC50 浓度应低于「无增强剂」的 EC50 浓度。

本试验中，Logistic 剂量反应模型的四个参数如下：

表1 Logistic 剂量反应模型的四个参数

图1 常规图

在对常规模型了解之后，我们使用实际的数据集来拟合此模型。

研究者进行一项小型试验，在四种浓度下各重复测量三次。在试验过程中，他们计算在500只跳蚤中被杀死的跳蚤数量。对于“无增强剂”组的数据，第二浓度组的数据被破坏了，所以如下方图2我们只得到三行数据。

图2 新建数据表

图3 数据表-输入数据

通过该试验数据绘制出的图4显示，随着剂量增加，反应也会增加。因此采用刺激模型比抑制模型更为合适。

图4 自动生成的图表

因为实际的浓度非常小，取对数可以让我们在一个更合理的范围上计算浓度。转换这些X值不会改变参数的最佳拟合值或它们的标准误差或置信区间。

图5 将浓度转换为对数显示

图6 数据表-对数转换结果

图7 四对数数据表的图表显示

我们可以从该初始数据集进行分析，操作如下：

【Analyze > XY analyses > Nonlinear regression (curve fit) > Dose-response -Stimulation > log (agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters)】

【分析> XY 分析>非线性回归（曲线拟合）>剂量反应-刺激>对数（激动剂）与反应-可变斜率（四个参数）】

图8 Analyze操作步骤

在结果表（图9）中，可以看到“有增强剂”模型有一组完整的参数估计和置信区间，但另一边“无增强剂”模型被标记为“不明确的”，这表示其显示的数据结果是不可信的。

图9 结果页

自8.2版本起，Prism可以查看是哪些参数会导致不明确的拟合。这些被称为不稳定参数，可以在分析时通过从置信度选项卡（Confidence tab）中选择“识别不稳定参数（Identify unstable parameters）”来设置；

或者在工具栏的Analyze右侧的按钮（上图按钮↑）来修改参数。

图10 设置“识别不稳定参数”

可以看到在“无增强剂”模型中，Top参数是不稳定的（如图11结果页）。在这个模型中存在一个不稳定参数并不奇怪，因为四参数logistic模型需要4个或更多X浓度数据，而“无增强剂”数据集中只有3个浓度的值。

图11 结果页-分析结果更新

当我们遇到不明确的模型时，可以试着通过将一个或多个参数设置为常数（constant）来减少模型中的参数数量。这需要我们了解反应（response）的行为方式。在这个试验中，研究者相信在非常低的浓度下其反应应该是零，目前的数据也证实了这一点，所以我们将通过输入0作为Bottom参数的约束来减少每个模型的参数数量，从4个减少到3个。这将两个模型的参数总数从8个减少到6个。一般来说，你估计的参数越少，模型收敛（converge）的可能性就越大。具体操作如下：

Analyze > XY analyses > Nonlinear regression (curve fit) > Dose-response -Stimulation > log (agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters)

【分析> XY分析>非线性回归（曲线拟合）>剂量反应-刺激>对数（激动剂）与反应-可变斜率（四个参数）】

图12 设置Bottom参数约束

如下图13，将Bottom设置为0，但 “无增强剂”模型中仍然有不稳定的参数。

图13 结果页分析结果更新

再次减少需要估算的参数数量。研究者认为这两种模型应该具有相同的曲线坡度（Hill Slope）。通过共享坡度（Hill Slope）参数，参数数量将从6个减少到5个。操作如下，

Analyze > XY analyses > Nonlinear regression (curve fit) > Dose-response -Stimulation > log (agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters)

【分析> XY分析>非线性回归（曲线拟合）>剂量反应-刺激>对数（激动剂）与反应-可变斜率（四个参数）】

图14 设置Hill Slope参数的约束

这样一来两个模型都收敛了，可以看到对于所有参数我们都有相应的估计和置信区间（如图15）。

图15 结果页分析结果更新

研究者希望这两条曲线的Maximal response都在400左右，而这些模型的曲线图都没有呈现出接近这个值的趋势。

图16 图表

为了更好地估计Top参数，研究者决定在-6.5的对数浓度（log concentration）下收集更多的数据（见图17），并确保它们具有相同的maximal response。通过Prism 8中的约束选项卡（the Constrain tab）来共享Top参数，只保留LogEC50参数不受约束（见图18）。操作如下：

【Analyze > XY analyses > Nonlinear regression (curve fit) > Dose-response -Stimulation > log (agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters)】

【分析> XY分析>非线性回归（曲线拟合）>剂量反应-刺激>对数（激动剂）与反应-可变斜率（四个参数）】

图17 五数据表更新

图18 设置Top参数约束

这个改进不错，两组模型中的Top参数都接近400了（如图19）。

图19 结果页分析结果更新 – Top

但可能会担心“无增强剂”模型中EC50值的估计，可以看到该模型中对数值是-5.84（如下图20）。

图20 结果页分析结果更新 – LogEC50

下面图21是最新生成的图表，在对数刻度上没有任何-5.84的数据，是因为我们对EC50的估计是基于外推法，意味着我们是在数据范围之外做预测。

图21 图表

为了避免这种外推（extrapolation），研究者决定收集额外的数据来捕捉“无增强剂”的剂量反应曲线的中间和右侧。

图22 数据表更新

在收集这些数据之后，没有通过外推法去估计，而是如更窄的置信区间所示，我们很好地估计了各项参数。

图23 结果页分析结果更新

如下图（图24）所示，我们按预期拟合了数据。

图24 图表

但是整个分析到这里还没有结束。由于到目前为止我们所看到的图显示的是均值而非原始数据，因此查看残差图以检查异常值是非常重要的。下方的QQ residual plot图（QQ残差图）（图26）显示存在一个异常值（outlier）。

图25 设置显示“QQ Plot”

图26 残差图

将这个异常值映射回数据集，可以看到它是在“无增强剂”组的高剂量情况下发生的（如下图27）。这个值输入错误，应为345。

图27 数据表更新

注意，这一点也可以通过在Method选项卡中选择“检测和消除异常值（Detect and eliminate outliers）”来识别和删除。操作如下，

Analyze > XY analyses > Nonlinear regression (curve fit) > Dose-response -Stimulation > log (agonist) vs. response -- Variable slope (four parameters)

【分析> XY分析>非线性回归（曲线拟合）>剂量反应-刺激>对数（激动剂）与反应-可变斜率（四个参数）】

图28 设置监测和消除异常值

图29 结果表-异常值提示

进行更改后，可以看到最终图形显示出更好的拟合度。

图30 最终图表

最终结果表的Bottom设置为0，两个模型的Top估计为360.2、Hill Slope估计为0.8923，“有增强剂”的EC50为6.769 * 10的负8次方，“无增强剂”的EC50为1.05 * 10的负6次方。根据这两个EC50值的比值，“无增强剂”浓度需要比“有增强剂”浓度大15.5倍，才能获得与“有增强剂”相同的效果。

图31 结果表最终分析结果

回顾本篇案例研究，我们讨论了包括以下几个方面：

1. 4PL模型参数的含义；

2. 如何检查不明确模型和不稳定参数；

3. 如何将参数设置为常数及其带来的好处；

4. 如何跨数据集共享参数及其带来的好处；

5. 如何避免外推；

6. 如何检查异常值