代谢网络相互关联并影响不同的细胞过程，由于代谢物经常以接近其细胞生理浓度的亲和力（微摩至毫摩）与靶蛋白相互作用，目前对于介导这些网络的蛋白质-代谢物相互作用（PMIs）的鉴定工作仍然有限。为此，来自美国犹他大学医学院的Jared Rutter团队在Science杂志上发表了一篇题为 Protein-metabolite interactomics of carbohydrate metabolism reveal regulation of lactate dehydrogenase 的文章，他们开发了与平衡透析相结合的能系统地识别PMIs的高灵敏度质谱平台（MIDAS），对来自人类碳水化合物代谢的33种酶进行分析确定了830种已知和未被报道的PMIs，并证明长链酰基辅酶A对乳酸脱氢酶的亚型特异性抑制，强调了MIDAS可作为鉴定具有重要功能的PMIs的有力工具。MIDAS利用平衡透析原理，如下图所示，代谢物能通过半透膜从代谢分子库中分离出来与蛋白质发生相互作用，随后将蛋白变性并对半透膜两侧的代谢物相对丰度进行量化，正倍数变化表示直接PMI且取决于结合亲和力，而代谢物的酶促转化的反应速率快于跨膜扩散速率可导致负倍数变化。研究人员首先对已被充分表征的PMIs进行初步验证，比如结合精氨酸的CASTOR1，结合亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的Sestrin2等，除了这些已知的相互作用外，还发现多胺衍生物也能与CASTOR1和Sestrin2 结合，说明MIDAS能有效识别已知的PMIs。于是作者进一步研究了33种涵盖糖酵解、糖异生、三羧酸循环等与碳水化合物代谢相关的酶，确定了830个PMIs，大多数为碳水化合物和碳水化合物代谢酶之间的互作，其余则主要是氨基酸、核苷酸和脂肪酸衍生物，通过与BRENDA和Recon3D数据库【1, 2】报道的PMIs比较发现，MIDAS显著识别了已知的底物、产物、激活剂和抑制剂，还包含许多之前未被报道过的物质，例如酰基辅酶A、烟酰胺、磷酸肌醇等与6-磷酸葡萄糖异构酶（GPI）相互作用等。图1. MIDAS平台是一种平衡透析串联FIA-MS（流动注射分析-质谱法）的方法通过对MIDAS数据分析发现亚型或同工酶之间存在PMIs差异，这可能提示它们的特定功能和调节模式，比如乳酸脱氢酶（LDH）A和B，它们具有不同的组织表达和底物反应动力学，通过MIDAS分析以及差式扫描荧光法（DSF）发现ATP与两者具有相似的结合亲和力，但ATP仅抑制LDHA亚型，这种异构体特异性抑制可能与ATP结合对两种蛋白热稳定性的相反影响有关。随后，作者研究了LDH亚型与CoA或与CoA与短链、中链或长链脂肪酸偶联物（如酰基辅酶A）的相互作用。作者观察到酰基辅酶A抑制LDHA可作为脂肪酸链长度的函数，单独的CoA或链长度为8的酰基辅酶A都不影响酶活性，但C12:0-CoA仅抑制LDHA，但长链酰基辅酶A如棕榈酰福诶A对LDHA的抑制对于NAD和乳酸都没有竞争性（已知LDH可以催化丙酮酸还原为乳酸且NADH氧化为NAD），表明它能在活性位点之外与LDHA结合。值得注意的是，与LDHA具有75%序列相同的LDHB对所有测试的酰基辅酶A完全不敏感。随后作者利用H9c2大鼠来验证了棕榈酰辅酶A对LDHA的抑制同样可以在体内发生。综上所述，作者验证了MIDAS作为发现关键代谢机制的工具，尤其对于检测低亲和力的PMIs，因而能够作为识别、理解和利用蛋白-代谢物相互作用组中先前未知的调节模式的渠道。
原文链接：
http://doi.org/10.1126/science.abm3452
1. E. Brunk et al., Nat. Biotechnol. 36, 272–281(2018).2. A. Chang et al., Nucleic Acids Res. 49, D498–D508(2021).
