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Science背靠背丨MINFLUX看见马达蛋白在活细胞中行走

马达蛋白行走(Stepping)的视频很多学生物的朋友们可能都看过,马达蛋白头上顶着大大的货物蛋白(Cargo),沿着微管或者微丝一步一步地前进。但是其实一直以来,马达蛋白在活细胞中怎么参与物质运输的并没有清晰的、单分子水平的认知。为了揭开马达蛋白行走的真实影像,德国分子生物学实验室Jonas Ries研究组与马普所Stefan W. Hell研究组背靠背在Science发文题为Direct observation of motor protein stepping in living cells using MINFLUXMINFLUX dissects the unimpeded walking of kinesin-1使用超分辨率显微镜技术MINFLUX揭开了马达蛋白行走的秘密。


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分子马达蛋白中成员之一驱动蛋白Kinesin对于识别细胞骨架纤维的极性进行细胞内定向货物运输和细胞分裂非常关键。为了理解微管正向末端驱动蛋白的动力学特征,单分子技术应运而生,比如光镊以及单分子追踪成像等【1-3】。这些研究表明驱动蛋白在运动中过程中以手拉手(Hand-over-hand)的方式前进,驱动蛋白N端每一步沿着微管16nm,导致驱动蛋白C端向前运动8nm(图2)。尽管现有单分子的技术在纯化的马达蛋白运动过程重建方面取得了巨大的成功,但是想在活细胞中获得驱动蛋白的单分子成像仍然是极大的挑战。

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图2 驱动蛋白运动模型

诺贝尔奖获得者Stefen Hall和同事开发了新一代超分辨率显微镜MINFLUX技术,这项发明则有可能克服传统光镊以及单分子追踪的局限性【4】。由于能够高效率应用单一荧光基团有限的光子,MINFLUX能够提供极高空间分辨率和时间分辨率的成像结果。有别于之前甜甜圈形状的激光照明,Wolff et. al.,改进了MINFLUX的发光方式,通过相位扫描器产生相差干涉照明,作者们试图将该技术应用于细胞内驱动蛋白货物运输单分子成像。

为了建立MINFLUX用于活细胞中的单分子追踪流程,作者们首先在体外优化了单分子以及荧光珠子的精确度与速度,能够达到定位精度2nm、时间精度亚毫秒。进一步地,作者们使用motor-PAINT技术优化了驱动蛋白的追踪,该技术中在加入荧光标记的驱动蛋白马达之前,将细胞进行渗透和固定。这一方法使用小的荧光标记在体外重建了微管,精度达到2nm左右。而且,驱动蛋白的方向性也揭示了微管的朝向。motor-PAINT与MINFLUX技术的联用将驱动蛋白成像的定位精度提高了5倍,时间精度提高了50倍。

为了驱动蛋白运动步长和饱和生理浓度下停留时间的分布特征进行刻画,作者们追踪了49个样本共计956步,驱动蛋白的每一步的距离为7.8nm左右,平均步长运动时间为30.8毫秒。为了对驱动蛋白运动的步长进行进一步地研究,作者们降低了ATP浓度进而降低驱动蛋白的运动速度,58%的驱动蛋白呈现锯齿状运动(Zigzag motion),每一步垂直于轨迹中心平均距离3.6nm。这些 结果表明MINFLUX可以用于揭示单个马达蛋白的动力学特征。

进一步地,作者们试图对活细胞中驱动蛋白的运动进行追踪,作者们使用了表达全长HaloTag-Kinesin的U2OS细胞。作者们发现驱动蛋白在活细胞中步长约为15.7nm,单个步长时间为46.8毫秒。随后,作者们使用短截形式的驱动蛋白,该形式的驱动蛋白中货物结合以及自抑制的结构域被去除,此时驱动蛋白的平均步长是16.2nm,但是每走一步所需要的时间降低为27.5毫秒。因此,MINFLUX可以用于揭示复杂细胞系统中单个马达蛋白的动力学特征。而且,通过增加横切面的视角,MINFLUX可以进一步地对活细胞中马达分子三维运动特征进行追踪。

总的来说,这两个工作背靠背通过使用高分辨率显微镜MINFLUX技术对马达分子Kinesin在体内单分子水平的时空特征进行刻画(图3)实现了在活细胞三维水平下对驱动蛋白运动的动力学进行追踪。

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图3工作模型

同期看法观点文章题为Watching biomolecules stride in real time,描述了该背靠背工作实现对单分子在活细胞中运动纳米水平、亚毫秒级别的实时追踪,MINFLUX技术将成为单分子动力学成像的重要工作平台。

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原文链接:

1. http://doi.org/10.1126/science.ade2676

2. http://doi.org/10.1126/science.ade2650


1. K. Svoboda, C. F. Schmidt, B. J. Schnapp, S. M. Block, Nature 365, 721–727 (1993).

2. S. Sudhakar et al., Science 371, eabd9944 (2021).
3. A. Yildiz, M. Tomishige, R. D. Vale, P. R. Selvin, Science 303, 676–678 (2004).
4.  F. Balzarotti et al., Science 355, 606–612 (2017)


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