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Nature子刊 | 中国科学院章新政等团队合作开发新技术实现蛋白质在细胞内的高通量、高分辨结构解析

冷冻电子断层扫描是用于研究蛋白质复合物原位结构的主要工具。但是断层要求对每一个区域收集倾转序列,这严重降低了原位的数据采集通量,并且倾转序列之间存在对中误差和冰层畸变等问题,导致分辨率难以突破。

2023年3月15日,中国科学院生物物理研究所章新政及北京理工大学万晓华共同通讯在Nature Communications 发表题为“Determining protein structures in cellular lamella at pseudo-atomic resolution by GisSPA”的研究论文,该研究基于isSPA算法进行了GPU加速优化,将计算效率提高了约400-500倍。

GisSPA允许高通量数据收集,而无需采集倾斜系列图像和重建断层图,这对于不对称或低对称蛋白质复合物的高分辨率重建至关重要。该研究证明了GisSPA分别以3.4埃和3.9埃分辨率分别展示了GisSPA在细胞板层中的藻胆体和四聚体光系统II复合体结构的能力。总之,该研究发现GisSPA是一种实用工具,有助于高分辨率原位蛋白结构测定。

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经过几十年的发展,单颗粒冷冻电子显微镜(cryo-EM)已经在apo-ferritin上以接近原子分辨率甚至原子分辨率确定了溶液中的蛋白质结构。然而,与纯化的蛋白质相比,处于工作状态的细胞环境中通常具有更多的天然构象并形成更完整的复合物。因此,原位求解蛋白质的结构是冷冻电镜的一个重要目标。
冷冻电子断层扫描(cryo-ET)是原位研究蛋白质结构的最常用工具在冷冻电子断层扫描中,收集倾斜系列图像以重建断层图。为了提高分辨率,已经开发了各种软件包,用于提高断层扫描和平均程序的质量。在网格上生长的微型细胞和肺炎支原体细胞具有约150纳米厚的区域,可以通过冷冻电镜直接成像。然而,大多数细胞太厚,无法进行透射电子显微镜成像。因此,聚焦离子束(FIB)已被用于研磨冷冻细胞以产生足够薄的薄片(150-200 nm)以用冷冻电镜成像。但据报道,变薄程序会在薄片中引起压力。薄片的导电性差和变薄引起的应力会导致成像过程中严重的光束诱导运动。纤维蛋白原铣削也可导致片层表面的辐射损伤和离子污染。因此,在高分辨率下解决薄层中蛋白质的结构是具有挑战性的。
虽然倾斜系列图像的收集可以通过光束偏移数据收集来加速,冷冻电子断层扫描通量仍然是单颗粒数据收集的1/30。因此,断层扫描中的数据收集吞吐量对于高分辨率结构来说是一个未解决的问题。此外,光束诱导运动引起的层析成像变形是限制重建分辨率的主要因素。多粒子系统建模已被证明可以纠正变形并有效提高分辨率。然而,这需要具有相同构象作为标记的高丰度蛋白质,或者与高丰度蛋白质共同精炼以纠正变形。
与三维(3D)断层扫描相比,蛋白质在二维(2D)冷冻电镜图像中与其他生物大分子重叠。为了在没有断层图和倾斜系列图像的情况下直接从这些2D图像中求解原位结构,目标蛋白质必须在密度重叠的冷冻电镜图像中平移和旋转定位。然后必须在重叠密度内局部细化结构,这已被证明对许多程序有效。Rickgauer等人使用高分辨率参比和白化过滤器在重叠密度内定位靶蛋白。然而,他们没有提供完整的工作流程来从具有重叠密度的局部颗粒中获得高分辨率结构。
研究者开发了isSPA方法,这是一个完整的工作流程,用于直接从冷冻电镜 2D 图像求解具有重叠密度的蛋白质结构。为了更好地定位靶蛋白,推导信噪比(SNR)加权函数,以重叠密度作为噪声来计算互相关。研究还设计了一种包含在isSPA中的分选方法,以去除假粒子并减少模型偏差效应。通过该工作流程,研究者成功解决了非冷冻切片样品中的高分辨率蛋白质结构,例如病毒颗粒上的糖蛋白、亚细胞器中的蛋白质复合物以及嵌入脂质体中的膜蛋白。
Lucas等人还在csTEM中实现了完整的工作流程(2DTM),并计算了玻璃化细胞中核糖体的结构,报告分辨率为4.3 Å。然而,他们表示,由于众所周知的模板偏差效应,估计的分辨率高得不切实际,因此,他们显示了20 Å的低通过滤结构。缺乏冷冻切片细胞样本的成功应用表明,蛋白质的全局定位和FIB研磨薄片结构的细化需要进一步探索。
该研究通过图形处理单元(GPU)加速的isSPA算法(GisSPA)进行了优化,大大提高了计算效率。研究了将GisSPA应用于纤薄的狼尾草(P. purpureum)细胞薄片的可行性。没有倾斜系列图像的情况下,该研究分别以3.4 Å和3.9 Å的分辨率解决了藻胆体(PBS)(1470万道尔顿(MD))和四聚体光系统II (PSII)复合体(1.5 MD)的结构。
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藻胆体(a)与光系统II(b)的高分辨原位结构
因此,GisSPA对于FIB薄片的高分辨率结构测定具有实用性和有效性研究还表明,定位效率取决于薄片厚度和目标蛋白的分子量。在细胞薄片上使用GisSPA时,蛋白质分子量的下限为1.1 MD,它涵盖了许多重要的蛋白质复合物,并且涵盖了几乎所有通过冷冻电子断层扫描在细胞薄片中报道超过10-Å分辨率的蛋白质复合物。
中科院生物物理研究所的章新政研究员和北京理工大学的万晓华副研究员为该论文的通讯作者,章新政组博士后程静和中科院计算所研究生刘童为共同第一作者。该工作受到国家重点研发计划、国家自然科学基金委、中国科学院战略性先导科技专项(B类)、中国科学院基础前沿科学研究计划等资助。

参考消息:
https://doi.org/10.1038/s41467-023-36175-y


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