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Nucleic Acids Res | 上海科技大学多单位合作,孙博/沈彬揭示Cas9蛋白高效靶向DNA的分子机制

化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 是一种可编程的 RNA 引导的 DNA 核酸内切酶,已被广泛用于生物和医学应用。SpCas9 和 DNA 之间的关键相互作用赋予该酶在基因组工程中的高度特异性。但是SpCas9蛋白存在脱靶效应,随之带来的随机性基因突变有着诸多风险。因此,深入了解SpCas9蛋白工作的分子机制,对提高编辑效率和准确性有重要指导意义。

2021年11月25日,上海科技大学孙博与南京医科大学沈彬共同通讯在Nucleic Acids Research 在线发表题为“Efficient DNA interrogation of SpCas9 governed by its electrostatic interaction with DNA beyond the PAM and protospacer ”的研究论文,该研究揭示了SpCas9的PI结构域中1151-1156区域内的四个赖氨酸与后PAM的带负电DNA磷酸骨架之间存在静电作用,通过改变该区域氨基酸的带电性可以对SpCas9的蛋白活性进行定向调控。此外,后PAM互作位点在功能上主要支配SpCas9的快速靶向DNA采样过程并参与到protospacer的解旋及R-loop的形成。
通过用具有不同电荷的氨基酸取代赖氨酸来调节这种相互作用,揭示了 SpCas9 的 DNA 靶标结合和切割活性对电荷的强烈依赖性。此外,与野生型 SpCas9 相比,SpCas9 突变体在 PAM 之外显示出明显可区分的 DNA 相互作用位点。在功能上,这种相互作用控制 DNA 采样并参与 DNA 询问过程中的原始间隔区 DNA 解旋。总的来说,对这种重要相互作用的机制和功能理解解释了 SpCas9 如何进行有效的 DNA 询问。该工作不仅揭示了SpCas9如何在众多基因中快速定位靶向DNA,同时也为提高其作为基因编辑工具的效率和准确率提供了关键的理论基础和开发方向。

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CRISPR/Cas系统为细菌和古细菌提供了针对外来遗传元件的基于 RNA 的适应性免疫。在 II 型 CRISPR-Cas 系统中,与包含 CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 crRNA (tracrRNA) 的双引导 RNA 复合的单个 Cas9 核酸内切酶足以靶向和切割互补的~20 碱基对 (bp) DNA 序列。通过将两个非编码 RNA 分子融合到一个单一的引导 RNA (sgRNA) 中,同时保留全功能的 Cas9 活性,可以进一步简化该系统。由于这些复合物的可编程 DNA 识别和切割的简单性和特异性,Cas9/sgRNA 系统已被证明是基因组工程应用中极其通用的工具 。
此外,催化死亡的 Cas9(dCas9,此后前缀“d”表示蛋白质的死亡版本)缺乏核酸内切活性但仍能与 DNA 靶标结合的蛋白质,已广泛用于活细胞中的转录扰动和基因组成像。为了确保它们在医学和生物学中的有效应用,大量的研究工作致力于提高它们的保真度并最大限度地减少脱靶效应。深入了解 Cas9 蛋白的分子机制将有助于这些改进。
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后PAM作用位点调控SpCas9采样及解旋DNA的分子机制模型(图源自Nucleic Acids Research 
Cas9/sgRNA 复合物的功能性核酸酶活性通常需要 DNA “采样”、PAM 识别、原型间隔区 DNA 解旋、R 环形成和亚结构域构象重排。复合物将脱靶效应降至最低的两个关键步骤是 PAM 识别和 R 环形成。对于最常用的来自化脓性链球菌 (SpCas9) 的 Cas9,不包含 PAM 序列的 DNA 靶标导致 SpCas9/sgRNA 复合物快速与它们分离,而 PAM 识别会导致几个碱基对的解旋PAM, 并通过引导 RNA (gRNA) 进行初始 DNA 询问 。在 DNA 解旋开始后,R 环形成从 PAM 近侧到 PAM 远侧定向发生。在这一步中,SpCas9/sgRNA 复合物进一步解开剩余的原始间隔区 DNA,置换非目标链 (NTS) DNA 并检查目标链 (TS) DNA 与 sgRNA的互补性。 
RNA-DNA 互补性是 SpCas9/sgRNA 复合物免受脱靶活性的第二层保护。sgRNA 与 PAM(“种子”区域)紧邻 5' 侧的 DNA 靶链之间的完美 8-12 bp 匹配对于 SpCas9 的 DNA 靶标结合和切割至关重要,而 PAM 远端区域的错配可能是耐受性。与 DNA 靶标复合的 SpCas9/sgRNA 的结构研究为三元复合物之间相互作用的分子基础提供了宝贵的见解。因此,已经开发了几种 SpCas9 衍生物来改善和扩大 PAM 识别,并在切割前对 RNA-DNA 互补发挥更高的严格性。了解 SpCas9-DNA 相互作用如何精确控制催化途径中的特定步骤,将对进一步改进非常有帮助。
单分子研究发现了一个意想不到的 SpCas9-DNA 相互作用,它位于 PAM 下游约 14 bp 处(称为 PAM 后相互作用)。该相互作用位点超出了 SpCas9 在 DNA 上的明显足迹。此外,还检测到金黄色葡萄球菌 Cas9 (SaCas9) 的类似 DNA 相互作用位点,突出了 Cas9 蛋白的进化保守特征。重要的是,该位点已被证明对 SpCas9 活性至关重要,因为该位点在 DNA 上的丢失或占用会显著损害 SpCas9 的 DNA 结合和切割活性。一致地,具有 55 bp DNA 底物的 SpCas9/sgRNA 的冷冻电镜结构表明存在该相互作用位点。然而,PAM 后相互作用在介导 SpCas9 活性中的功能作用在很大程度上仍然未知。 
在此,该研究使用单分子、生化和体内 DNA 切割分析阐明了 PAM 后相互作用在调节 SpCas9 活性中的机制和功能。四个 SpCas9 突变体的实验表明,这种相互作用确实源于残基 1151-1156 与 DNA 骨架之间的四个带正电荷的赖氨酸之间的静电力。这些突变体在 DNA 靶标结合和切割方面表现出不同的酶活性,这对残留电荷有很强的依赖性。然而,一旦成功与 DNA 靶标结合,它们就会与它紧密结合数小时而不会解离。此外,该研究提供了证据表明这种 PAM 后相互作用在 DNA 采样和原始间隔区 DNA 解旋中起作用。基于这些结果,该研究提出了一个机制模型来解释 PAM 后相互作用如何协助 SpCas9/sgRNA 复合物进行有效的 DNA 询问。
该论文中,孙博教授课题组2017级博士生张倩(已毕业)及2020级博士生陈紫婷为共同第一作者,孙博教授和沈彬教授为共同通讯作者,上海科技大学为第一完成单位。参与该工作的还有上海科技大学生命学院黄行许教授。上科大分子细胞平台的工作人员对该项研究提供了技术帮助。该工作得到了科技部、国自然基金委、上海市科委以及上科大启动基金的支持。

参考消息:
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab1139/6439681#



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